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《功能基因组学》全面总结了功能基因组学的基本原理以及国内外在基因功能研究领域的主流技术和**发展趋势，共13章，分为四个部分。**部分（1~3章）概述核酸操作的主要工具和方法。第二部分（4~6章）系统地介绍了基因的克隆、定位和表达体系。第三部分（7~9章）归纳了功能基因组学研究的主要方法，涉及动物模型、蛋白质相互作用、定点突变、基因表达谱以及RNA干扰等多个方面。第四部分（10~13章）具体分析突变体在植物基因功能研究中的重要作用。

目录

前言

1 绪论 1

1.1 经典遗传学(1857~1943年) 1

1.2 分子遗传学(1944~1972年) 4

1.3 基因工程技术(1973年至今) 6

1.4 功能基因组学 13

1.5 基因工程与生物安全 16

2 基因操作的主要方法和工具 20

2.1 分子生物学基本知识 20

2.1.1 遗传信息 20

2.1.2 基因和基因组 23

2.1.3 可转座元件 36

2.2 核酸操作 43

2.2.1 核酸的分离和检测 43

2.2.2 核酸的序列测定 48

2.3 限制性内切核酸酶 55

2.3.1 限制性内切核酸酶的类型 55

2.3.2 Ⅱ型限制性内切核酸酶 58

2.3.3 限制性作图 63

2.4 连接酶和聚合酶 65

2.4.1 DNA和RNA连接酶 65

2.4.2 DNA聚合酶 66

2.4.3 RN聚合酶 68

2.5 DNA修饰酶 70

3 受体细胞和载体 71

3.1 受体细胞类型 71

3.2 大肠杆菌质粒载体 72

3.2.1 克隆性质粒载体 73

3.2.2 改进的质粒载体 75

3.3 大肠杆菌噬菌体载体 76

3.3.1 λ噬菌体载体 77

3.3.2 M13噬菌体载体 83

3.3.3 质粒与噬菌体杂合性载体 85

3.4 植物基因工程载体 87

3.4.1 Ti质粒 87

3.4.2 Ri质粒 90

3.4.3 植物病毒载体 91

3.4.4 质体基因工程载体 92

3.5 动物基因工程载体 94

3.5.1 反转录病毒载体 94

3.5.2 腺病毒载体 97

3.5.3 SV40病毒载体 98

3.5.4 其他哺乳动物病毒载体 99

3.5.5 昆虫细胞的杆状病毒载体 100

3.6 酵母基因工程载体 101

3.6.1 酿酒酵母载体 101

3.6.2 毕赤酵母载体 102

3.7 基因组载体 103

3.7.1 酵母人工染色体 103

3.7.2 BAC载体和F黏粒 105

3.7.3 P1噬菌体载体和PAC载体 106

3.8 DNA向宿主细胞的导入方法 107

4 基因的克隆与鉴定方法 110

4.1 基因的化学合成 110

4.2 目的基因的克隆策略 111

4.2.1 根据已知碱基序列或氨基酸序列克隆基因 113

4.2.2 根据表型变异克隆基因 114

4.2.3 基于图谱的基因克隆方法 119

4.3 文库的构建与目的基因克隆 123

4.3.1 cDNA文库的构建 124

4.3.2 基因组文库的构建 131

4.3.3 目的基因克隆的鉴别与分析 133

4.4 聚合酶链反应与基因克隆 143

4.4.1 PCR的基本特征 144

4.4.2 改进的PCR技术 147

4.4.3 实时PCR 151

4.4.4 PCR与目的基因序列的克隆 154

4.5 通路克隆系统 155

4.5.1 LR反应 155

4.5.2 BP反应 156

5 基因定位和基因组作图 158

5.1 遗传作图与基因定位 160

5.1.1 RFLP与基因定位 161

5.1.2 RFLP与遗传作图 163

5.1.3 其他分子标记 167

5.2 人类基因的定位方法 170

5.2.1 家系分析法 170

5.2.2 细胞融合与基因定位 172

5.2.3 异常染色体与基因定位 174

5.2.4 分子杂交与基因定位 175

5.3 物理图谱的构建 176

5.4 基因组计划 179

5.4.1 克隆重叠群 180

5.4.2 基因组序列的测定与组装 181

5.4.3 人类基因组计划 182

5.5 基因序列的分析 187

5.5.1 基因序列的分辨和验证 187

5.5.2 基因的结构与表达分析 189

6 原核与真核细胞表达体系 193

6.1 原核基因表达调控 193

6.1.1 原核基因表达的基本特征 193

6.1.2 操纵子学说 197

6.1.3 大肠杆菌细胞中的突变基因 199

6.2 原核细胞表达体系 201

6.2.1 大肠杆菌表达体系 201

6.2.2 其他原核表达体系 213

6.3 真核基因表达调控 214

6.3.1 真核基因的转录与翻译 214

6.3.2 真核细胞周期的调控基因 222

6.4 真核细胞表达体系 228

6.4.1 酵母表达体系 229

6.4.2 昆虫细胞杆状病毒表达体系 237

6.4.3 哺乳动物细胞表达体系 238

7 基因功能研究与基因工程药物 243

7.1 重组蛋白质药物 243

7.1.1 蛋白质工程 243

7.1.2 重组治疗性药物蛋白 244

7.1.3 新型抗体分子 246

7.1.4 基因工程疫苗 254

7.2 细胞因子 255

7.2.1 细胞因子的一般生物学特征 256

7.2.2 介导和调节先天性免疫的细胞因子 258

7.2.3 介导和调节适应性免疫的细胞因子 266

7.2.4 与T细胞分化和造血功能有关的细胞因子 272

7.2.5 细胞因子与信号转导 275

7.3 基因治疗 282

7.3.1 人类疾病的基因诊断 282

7.3.2 基因治疗 285

7.3.3 遗传指纹 296

8 基因功能研究的主要方法 300

8.1 通过动物模型研究人类基因的功能 300

8.1.1 转基因动物与克隆动物 300

8.1.2 动物乳腺生物反应器 306

8.1.3 动物模型和基因敲除技术 308

8.2 通过蛋白质相互作用研究基因功能 310

8.2.1 酵母双杂交技术 311

8.2.2 表面展示技术 320

8.2.3 免疫共沉淀技术 323

8.2.4 蛋白质亲和层析技术 324

8.2.5 交联技术和荧光共振能量转移技术 326

8.2.6 抗原表位的鉴定与分析方法 327

8.2.7 免疫磁珠和荧光微球技术 332

8.3 通过定点突变技术研究基因功能 336

8.3.1 早期的定点突变技术 336

8.3.2 改进的定点突变技术 337

8.3.3 PCR定点突变技术 339

8.3.4 利用定点突变技术研究核孔复合体转运机制 343

8.4 通过基因表达谱和表型变化研究基因功能 348

8.4.1 基因表达的差异分析 349

8.4.2 功能补偿分析和突变体库技术 358

8.4.3 数据库搜索与基因功能验证 363

8.4.4 基因芯片技术和基因表达谱分析 365

8.4.5 基因传感器 370

9 RNA干扰与基因功能研究 372

9.1 RNA干扰的一般生物学特征 372

9.1.1 RNA干扰的基本步骤 373

9.1.2 siRNA、stRNA和smRNA375

9.1.3 RNA干扰技术 377

9.1.4 RNA干扰与表观遗传学 379

9.2 参与RNA干扰过程的主要蛋白质 380

9.2.1 RdRP 380

9.2.2 Dicer酶 384

9.2.3 Argonaute蛋白 385

9.3 染色质结构与RNA干扰 388

9.3.1 染色质结构与表观基因沉默 388

9.3.2 RNA干扰与可转座元件的异染色质化 392

9.4 RNA干扰与植物基因功能研究 396

9.4.1 植物中的基因共抑制现象 396

9.4.2 转录后基因沉默 398

9.4.3 双链RNA对基因组的调节作用 401

9.4.4 通过RNAi技术确定植物基因功能 404

9.4.5 沉默载体向植物细胞的导入方法 411

9.5 RNA干扰与动物基因功能研究 412

9.5.1 RNA干扰与线虫基因功能研究 413

9.5.2 RNA干扰与果蝇基因功能研究 418

9.5.3 RNA干扰与哺乳动物基因功能研究 423

10 植物基因功能研究的特殊方法 431

10.1 植物基因组 431

10.1.1 植物基因组的基本特征 431

10.1.2 表观遗传与基因表达 434

10.1.3 植物细胞周期的调节特征 436

10.2 植物基因工程 438

10.2.1 植物遗传转化 438

10.2.2 植物抗性基因工程 440

10.2.3 高等植物的质体基因工程 444

10.2.4 植物基因工程技术在医学中的应用 445

10.3 植物基因表达的调控方式 447

10.3.1 植物基因的启动子 447

10.3.2 RNA加工和RNA编辑 452

10.3.3 转录因子和顺式元件 454

10.3.4 转移基因的表达调控 456

10.4 植物遗传转化的选择体系 463

10.4.1 常用的植物标记基因 463

10.4.2 植物遗传转化的正选择体系 466

10.5 植物诱导表达体系和定点重组系统 470

10.5.1 植物基因表达的诱导体系 470

10.5.2 T7 RNA聚合酶——植物耦联表达体系 472

10.5.3 定点重组系统 472

10.6 植物细胞结构相关蛋白的功能研究 475

10.6.1 植物细胞中膜蛋白的功能研究 475

10.6.2 细胞壁蛋白的功能研究 480

10.6.3 细胞骨架蛋白的功能研究 485

10.6.4 液泡蛋白的功能研究 487

11 突变体与植物代谢基因功能研究 491

11.1 氨基酸合成代谢基因的功能研究 491

11.1.1 芳香族氨基酸合成 491

11.1.2 脯氨酸合成代谢途径 496

11.1.3 其他氨基酸合成代谢突变体 497

11.1.4 固氮作用 499

11.1.5 植物细胞对氨的同化过程 500

11.1.6 次生产物合成代谢基因的功能研究 501

11.1.7 含硫氨基酸及其衍生物的功能 503

11.2 脂类合成代谢基因的功能研究 505

11.2.1 植物脂类代谢突变体 505

11.2.2 脂类基因工程 509

11.2.3 聚-3-羟基链烷酸 512

11.3 光合作用和淀粉合成代谢基因的功能研究 513

11.3.1 突变体与光合作用研究 513

11.3.2 类胡萝卜素的生物合成 515

11.3.3 淀粉合成代谢 515

11.4 物质转运突变体 519

11.4.1 钾离子转运 519

11.4.2 磷的转运 520

11.4.3 微量元素转运蛋白 521

12 突变体与植物形态发生和开花基因功能研究 523

12.1 控制分生组织和信号转导的基因 523

12.1.1 芽和根的发生 523

12.1.2 突变体与植物信号转导研究 525

12.2 植物激素合成代谢基因的功能 527

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1 绪论

　　1.1 经典遗传学（1857~1943年）

　　经典遗传学的创始人是奥地利的伟大科学家孟德尔（G.J.Mendel）。1857~1864年，孟德尔以豌豆（Pisum sativum ）为实验材料进行了大量系统的杂交实验，提出了特殊因子（particular factor；也称为遗传因子，hereditary factor）这一概念，将性状（表型，phenotype）与可遗传因子（基因型，genotype）联系到了一起。孟德尔的豌豆实验一共研究了8对简单性状，分别为种子形状（圆形和皱形）、种子颜色（黄色和绿色）、种皮颜色（灰色和白色）、花的颜色（紫色和白色）、种荚形状（膨胀和皱缩）、种荚颜色（绿色和黄色）、植株高度（长秆和矮化）和花在植株上的位置（花和豆荚沿轴排列，花和豆荚位于末端）。他采用的主要方法是在花药释放花粉之前剪去未成熟花药，再将另一个亲本的花粉涂抹到**个亲本的柱头上，然后对杂种**代和第二代进行观察。基于大量的统计学分析，孟德尔提出了遗传学的两个基本规律，分离规律（the principle of segregation）和自由组合规律（the principle of independent assortment）。分离规律指一个基因的两种等位形式在配子形成过程中会发生分离，一种配子得到一个等位基因，另一种配子得到另一个等位基因。自由组合规律认为与不同性状有关的基因在配子形成过程中是独立的，等位基因以随机方式进行组合。孟德尔认为生物的每一种性状都是由特殊的遗传因子控制的，两个不同的个体杂交产生的下一代可能与亲本之一完全相同，他把这一现象称为统一律，并认为遗传因子可以代代相传；在体细胞内，遗传因子是成对存在的，其中一个来自父本，另一个来自母本；在形成配子时成对的遗传因子彼此分开，单独存在。他还认为，有些遗传因子以显性（dominant）形式存在，即在任何杂种一代个体中都能够表达；而有些遗传因子呈隐性（recessive）状态，只有当父本和母本同时含有这一因子时，才能在一些子代中表达。但是，从1865年孟德尔发表“植物杂交试验”一文到1884年逝世，科学界几乎无人理睬他的巨大贡献。

　　孟德尔的研究结果在1900年整理德国植物学家Carl von Nageli资料中的一些信件时重新被发现。这些信件显示孟德尔也在其他植物上进行了试验，他在一些以无性方式繁殖的植物中进行的杂交实验是失败的。孟德尔当时也认为豌豆中表现出的遗传规律的适用范围可能是有限的。信件还显示孟德尔后来又进行了玉米杂交实验，并进一步确证了他在豌豆实验中得到的结果。

　　孟德尔提出的分离规律和自由组合规律适用于所有非连锁基因，他的实验能够成功取决于以下几个因素：**，豌豆为自花受精（self-fertilized）植物，可以控制授粉过程，便于人工杂交；第二，他挑选的性状属于简单性状，每一种性状有两种不同的形式，杂交一代中只显示其中一种；第三，孟德尔在每次杂交实验中挑选的性状不多于两个，能够在可控的遗传背景下跟踪每个性状的传递规律；第四，他没有观察连锁性状，这一点十分幸运；第五，他分析的样本很大，可通过统计学方法进行分析。豌豆种子的皱皮表型是孟德尔遗传学实验中讨论*多的性状，现在已从分子水平揭示了该表型的形成机理，并克隆了与之有关的基因。皱皮表型由一个基因突变引起，该基因编码淀粉分支酶SBEI（starch-branching enzyme isoform），这种突变降低了种子中淀粉的含量，增加了蔗糖浓度。蔗糖可以作为渗透剂，细胞内蔗糖浓度升高时，水分会进入细胞，使种子体积变大，鲜重增加。当成熟种子干燥后，突变种子大量失水，所以种皮会变皱。

　　早期的遗传学、细胞学和生物化学研究是相互独立的。直到1903年，W.Sutton和T.Boveri通过对染色体的细胞学观察提出了遗传的染色体理论（chromosome theory of heredity）。染色体在光学显微镜下是可见的，并且可以一个个加以区分。当时已发现染色体总是始终如一地从上一代传递到下一代，与性状的传递规律相似。由于染色体的行为与遗传因子的行为十分相似，所以Sutton和Boveri推论孟德尔因子（Mendelian factor）存在于染色体上，染色体可能是遗传物质的载体。1909年，W.L.Johannsen提出“基因”（gene）一词，用来代替孟德尔提出的“遗传因子”概念。

　　1905年，W.Bateson、E.R.Saunders和P.C.Punnett在进行香豌豆（Lathyrus odoratus）杂交试验时注意到基因对的自由组合并不是**的，他们通过杂交实验发现染色体片段可以交换。按照我们熟知的自由组合规律，当两个拥有两种不同性状的亲本杂交时，F1代会显示出两种性状中的显性形式，F1代自交产生的F2代将表现出9：3：3：1的分离比率。但是，Bateson和他的同事却得到了不同的结论。他们所用的两个亲本中，一个具长花粉和紫花表型，另一个具圆花粉和红花表型。杂交之后，F1代显示出期望的显性表型（紫花长花粉）。但F1代自交后，绝大部分F2代植株产生紫花长花粉或红花圆花粉，说明F2代类似于亲本中的任何一个。另外，这一实验也产生了少量的非亲本表型，紫花圆花粉和红花长花粉。这意味着在配子形成过程中并不是所有的基因都遵循孟德尔的自由组合规律。

　　同一时代的摩尔根和他的同事在果蝇（Drosophila melanogaster）中也做着同样的工作，他们选择的性状为果蝇复眼的颜色和翅的大小，所获结果也不同于自由组合规律。摩尔根及其同事推论，如果在一条染色体上控制不同性状的孟德尔因子相互靠近时，它们可能会一起遗传，亦即它们是连锁的，一组连锁基因构成了一个连锁群（linkage group）。少数非亲本型可用两个遗传因子之间的连锁在配子形成过程中被随机打断进行解释，并由此产生新的孟德尔因子组合，这一过程被称为重组。遗传因子之间距离越近，重组的机会就越低。进一步的工作将这种现象与同源染色体之间的交换（crossing-over）联系到了一起，重组率（recombinant frequency）在后来被当作同一染色体上两个不同基因之间距离的相对指标。

　　1910年，摩尔根提出基因的连锁和交换规律，创立了遗传的染色体理论，将决定性状的基因同染色体联系到了一起。他所选用的*重要的果蝇性状是复眼的颜色，野生型果蝇为红眼，突变体果蝇为白眼。复眼的颜色与X染色体连锁，F2代所有的白眼果蝇都是雄性个体。当摩尔根认识到部分连锁可以通过减数分裂过程中发生的交换现象给予解释时，他开始考虑如何设计一种方法来确定基因在染色体上的位置。他的研究生Arthur Sturtevant取得了关键性的突破，发现因交换使两个连锁基因分开的频率同它们在染色体上所处位置之间的距离成正比，因此重组率可作为测量基因之间距离的相对尺度。为了纪念摩尔根对遗传学的重大贡献，1%重组率被定义为一个cM（厘摩尔根）。在遗传学实验中，只要获得不同基因之间的重组率，就可以绘制一张关于不同基因在染色体上相对位置的图谱，这就是遗传图谱。例如，A1 是玉米3号染色体上与种子花青素颜色有关的基因（紫色种子），Etched 基因与种子形状有关（蚀刻形种子），这两个基因之间的重组率为12%，也即图距（map unit）为12cM。Mdh3 基因编码苹果酸脱氢酶（malate dehydrogenase），Sh2 （shrunken kernel）基因与皱缩种子有关。Mdh3 与A1 之间的重组率为3%，Sh2与A1之间的重组率为0.2%。20世纪80年代产生的限制性片段长度多态性（RFLP）标记也可以当作表型性状用于遗传作图，cdo455、umc#63、csu305为玉米3号染色体上的几个RFLP。现在的遗传图谱上既有基因，也包括很多分子标记。

　　1916年，C.B.Bridges将果蝇X染色体的不分离现象与特殊的遗传性状联系起来，发现这一现象发生在减数分裂过程中同源染色体不分离的情况下，一些子代细胞拥有某一条染色体的两个拷贝，而另外一些子代细胞丢掉了某一条染色体。之后在研究玉米的细胞遗传学特征时很多出色的工作也将染色体和基因联系到了一起。玉米有10对染色体，大小不一，1号*长，10号*短。20世纪30年代早期，B.McClintock研究了三体玉米，发现在杂交过程中产生三体表型的比率与带有特殊基因群体的额外染色体有关，利用三体特征和表型性状可将一个基因定位在某一条染色体上。B.McClintock通过这种方法将玉米三体染色体和一个影响糊粉层颜色的基因（R，red）联系到一起，她发现回交后代的表型比例决定于该基因在亲本中的数量。

　　染色体交换首先是在玉米中被观察到的。H.B.Creighton和B.McClintock使用了一个带有非正常染色体的玉米株系，该株系9号染色体短臂上有一个大的染色结（knob），同时由于8号染色体片段的易位，9号染色体长臂加长。这种突变的9号染色体包含有控制种子糊粉层颜色的C基因（C 为显性，无色为隐性，该基因靠近染色结）和种子胚乳蜡质基因wx（显性为非蜡质，wx为隐性，靠近8号染色体易位片段）。Creighton和McClintock正是利用找到的两种细胞学标记（染色结和加长的染色体臂）和两种遗传标记（控制两种性状的基因），观察到了染色体的交换现象。用含正常9号染色体的亲本与含突变9号染色体的亲本杂交，可将染色体的物理特征与其包含的基因的遗传模式联系起来。每当他们观察到一种重组表型时，细胞学标记显示在knob/C 位置和易位的8号染色体片段/wx位置之间的某个位点就发生染色体物质的交换。带有c和Wx正常9号染色体的亲本与带有C和wx变异9号染色体的亲本杂交后，下一代在配子形成时由于交换可使遗传标记和细胞学标记发生重排；在F2代产生的一种重组型染色体带有C和Wx，有结；另一种带有c 和wx，具有8号染色体易位片段。

　　20世纪前40年，遗传学领域的研究热点是遗传作图（genetic mapping）。遗传作图的目的是将基因标定在具体的染色体上，并用重组率显示出它们之间的距离，连锁群这一重要概念被用来描述存在于同一条染色体上的连锁基因。有些情况下，连锁群指相互连锁的多个基因或标记，但尚未确定它们位于哪一条具体的染色体。对于染色体组型还没有研究清楚的物种，连锁基因只能用连锁群来界定。在这一时期，另外一个重要进展是发现了细菌的转化现象。

　　从以上分析可以看出，遗传学早期的研究路线具有由表及里的特征，具体表现为从性状到基因，然后将基因定位到染色体上。摩尔根学派将决定特定性状的基因同特定的染色体联系到一起，使科学界普遍认识到了染色体的重要性并接受了孟德尔的遗传学原理。

　　1.2 分子遗传学（1944~1972年）

　　从孟德尔提出遗传因子到基因被定位到染色体上，大约花了50年时间。尽管由于摩尔根及其学派的出色工作，使基因学说得到了普遍承认，但20世纪上半叶人们对于基因的理解仍然是抽象的、概念化的，缺乏具体内容，就像我们现在对“意识”的理解一样。当时还不能解释基因在细胞增殖过程中是如何准确地复制和遗传的，也不能解释位于细胞核中的染色体和基因是怎样控制显然发生在细胞质中的各种生化过程的。基因的结构特征和遗传信息的表达过程一直到20世纪五六十年代才初见端倪。

　　1869年，F.Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离到DNA。由于核酸在细胞中的含量很低，人们一直认为它并不重要，而将主要精力用于蛋白质、脂类和多糖的研究；所以在后来的很长时间里，核酸研究备受冷落，大多数人认为它只不过是一种能够在70%乙醇溶液中形成线状沉淀的酸性物质。直到20世纪40年代，人们终于明白DNA是传递遗传信息的分子，并发现染色体由蛋白质和DNA构成，DNA携带有遗传信息。因此，从基因被定位于染色体上到发现遗传信息的载体分子是DNA，又走过了大约50

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高等学校和科研机构相关教师和研究人员，生物科学和生物技术专业高年级本科生和研究生

书籍介绍

《功能基因组学》全面总结了功能基因组学的基本原理以及国内外在基因功能研究领域的主流技术和最新发展趋势，共13章，分为四个部分。第一部分（1～3章）概述核酸操作的主要工具和方法。第二部分（4～6章）系统地介绍了基因的克隆、定位和表达体系。第三部分（7～9章）归纳了功能基因组学研究的主要方法，涉及动物模型、蛋白质相互作用、定点突变、基因表达谱以及RNA干扰等多个方面。第四部分（10～13章）具体分析突变体在植物基因功能研究中的重要作用。

《功能基因组学》可供高等学校和科研机构相关教师和研究人员使用，也可以作为生物学和生物技术专业高年级本科生的研究生教材。